کروماتوگرافی لایه نازک
مبحث روش کار و استفاده از کوماتوگرافی لایه نازک (TLC)
کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography) با نام متداول و اختصاری TLC از تکنیک¬ های ساده و کاربردی کروماتوگرافی است. در این روش برای جدا کردن اجزاء یک مخلوط از یک فاز ثابت نازک که روی یک بستر بی ¬اثر قرار گرفته است، استفاده می شود. این تکنیک ممکن است در مقیاس آنالیزی به عنوان ابزاری برای نظارت بر پیشرفت یک واکنش سنتزی یا در مقیاس تهیه ¬ای برای خالص ¬سازی مقادیر کم یک ترکیب استفاده ¬شود. TLC ابزاری آنالیزی است که به دلیل سادگی، هزینه کم نسبی، حساسیت بالا و سرعت جداسازی بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. هدف TLC به دست آوردن نقاط تعریف شده و جدا از هم است.
بخش های مهم در کروماتوگرافی لایه نازک
در کروماتوگرافی لایه نازک دو فاز داریم:
1. فاز ساکن (Stationary phase)
2. فاز متحرک(Mobil phase)
فاز ثابت(ساکن)
صفحات TLC (که به عنوان صفحات کروماتوگرافی نیز شناخته می¬ شوند) می¬ توانند در آزمایشگاه تهیه شوند، اما بیشتر آنها به صورت تجاری قابل تهیه می ¬باشند. سیلیکاژل و آلومینا از رایج ترین فاز ساکن هستند، اما سایر موارد نیز در دسترس هستند. برای مرحله تشخیص لکه¬ ها بسیاری از صفحات آغشته به ترکیبی هستند که تحت اشعه ماوراء بنفش موج کوتاه (254 نانومتر) فلورسانس می¬ شوند. بستر بی اثر صفحات TLC اغلب از شیشه، آلومینیوم یا پلاستیک تشکیل شده است.
حلال (فاز متحرک)
انتخاب صحیح حلال یا فاز متحرک شاید مهم ترین بخش TLC باشد و تعیین بهترین حلال ممکن است به یک آزمایش و خطا نیاز داشته باشد. همانند انتخاب صفحه، خواص شیمیایی آنالیت ¬ها نقش مهمی در کارایی جداسازی داشته و باید آنها را نیز در نظر داشت.
اگر یک جزء از مخلوط در یک حلال معین نامحلول است، اما یکی دیگر از اجزای آن به خوبی در آن محلول است، غالبا جداسازی¬ های خوبی در کروماتوگرافی لایه نازک به دست می ¬آید.
وسایل مورد نیاز در انجام آزمایش
صفحه TLC که از قبل آماده داریم
تانک TLC
نمونه زعفران
پیپت
بشر
آون
مواد مورد نیاز
بوتانل
اسید استیک
آب مقطر
مراحل انجام آزمایش
1. در مرحله اول صفحه TLC که سلیکاژل روی اش کشیده شده است باید داخل آون 105 درجه به مدت 30 دقیقه بگذاریم که صفحه ما فعال شود.
2. برای آزمایش زعفران مبایل فاز بوتانل/اسیداستیک/آب مقطر باشد به نسبت های ذیل:4/1/1
3. مقدار کلی مبایل فاز 30 ملی لیتر بوده 20 ملی لیتر بوتانل، 5ملی لیتر اسیداستیک و 5ملی لیتر آب مقطر
4. بعد از اینکه مبایل فاز را آماده کردیم داخل تانک TLC می اندازیم.
5. لکه گذاری نمونه و مشخص کردن Baseline and solvent front در صفحه TLC
6. لکه¬ ها با استفاده از پیپت¬ های شیشه ¬ای بسیار نازک روی صفحه قرار می ¬گیرند. لوله مویینه باید به اندازه کافی نازک باشد تا لکه ه¬ای مرتب داشته باشد، اما آنقدر نازک نباشد که مانع از جذب مقدار کافی آنالیت شود. نمونه مجهول و استاندرد آن به فاصله مشخص روی Beas line نقطه گذاری شود.
نکات قابل توجه
هنگام انجام آزمایش فاز متحرک که یک حلال است باید پایین تر از Beas line قرار گیرند و زمانیکه فاز متحرک با لکه نمونه حرکت می کند قبل از رسیدن به solvent front باید متوقف شود.
صفحه را به اندازه صحیح برش داده و با استفاده از یک مداد (هرگز از خودکار استفاده نشود)، به آرامی یک خط مستقیم روی صفحه تقریباً 1 سانتی متر از پایین بکشید. هنگام کشیدن خط روی صفحه TLC از نیروی بیش از حد استفاده نکنید زیرا این کار فاز ساکن را از بین می برد. استفاده از مداد به جای قلم بسیار مهم است زیرا جوهرها معمولا با حلال به بالای صفحه حرکت می¬ کنند.
بعد از اینکه صفحه از داخل تانک کشیده شد ب اسرا وقت در قسمت نهایی حرکت حلال یک خط کشیده شود.
مشاهده لکه
چون نمونه مورد آزمایش ما زعفران است به همین خاطر لکه رنگی زعفران با چشم قابل دید بوده و به راحتی می توان فواصل لکه ها را مشاهده کرد.
فاکتور بازداری
پس از کامل شدن جداسازی، ترکیبات جداگانه بصورت لکه های عمودی از همدیگر جدا می شود. هر نقطه دارای یک فاکتور بازداری بوده که برابر به مسافت طی شده توسط جز مورد نطر تقسیم بر مسافت طی شده توسط حلال است..
مسافت طی شده توسط حلال / مسافت طی شده توسط جزء مورد نظر = RF
آزمایش نمونه قند در کروماتوگرافی لایه نازک
برای آزمایش نمونه قند در TLC عین مراحل نمونه زعفران می باشد، اما در آزمایش نمونه قند مبایل فاز(فاز متحرک) آب و متانول می باشد.
آب/متانول به نسبت های ذیل می باشد:
5%آب و 95%متانول 1.5ملی لیتر/28.5ملی لیتر
چون لکه های قند نامریی می باشد، لازم است که برای مشاهده لکه قند از معرف استفاده نمایم.
معرف که برای قند استفاده می شود اسید سلفوریک 5% در ایتانول می باشد(5%اسید سلفوریک و 95%ایتانول) اضافه شود.
زمانیکه معرف اسید سلفوریک و ایتانول را اسپری کردیم باید برای مدت 5 دقیقه داخل آون بگذاریم که لکه ای نمونه مشخص شود.
نکته قابل توجه: هنگام اسپری نمودن معرف باید از فاصله دورتر اسپری شود، چون اسید سلفوریک خیلی مضر است.
بعد ازاینکه صفحه را از آون در آوردیم نمونه به شکل لکه سیاه رنگ روی صفحه مشخص می شود.
اندازه گیری فاکتور بازداری قند
RF=فاصله طی شده توسط نمونه/فاصله طی شده توسط حلال
فاصله طی شده از Beas line الی لکه نمونه=4.5 سانتی متر
فاصله طی شده از Beas line الی solvent front(چون مبایل فاز از solvent front تقریبا عبور کرده بود)=6سانتی متر
RF=4.5cm/6cm=0.75cm
